Сверхразрешающий микроскоп приходит в вашу лабораторию
Немецкое общество Макса Планка и производитель микроскопов Leica Microsystems объединили усилия для коммерциализации новой техники, чтобы создать оптические микроскопы, позволяющие рассмотреть еще меньшие объекты, чем это было возможно раньше. Этот последний способ основан на STED микроскопии, техники позволяющей перейти дифракционный предел, и была впервые продемонстрирована более десяти лет назад Стефаном Хэлем (Stefan Hell).
Оптическая микроскопия является предпочтительным инструментом биологов, поскольку она может быть использована для изучения живых клеток в их естественной среде. Однако, у нее есть одно главное ограничение: она не может нормально разрешать объекты размером менее 200 нм, так называемый дифракционный предел. Основной прорыв произошел около десяти лет назад, когда Стефан Хэль и его коллеги из Института Макса Планка по биофизической химии в Геттингене, Германия, изобрели STED микроскопию.
Метод включает в себя флуоресцентную микроскопию, при котором интересующие молекулы помечены красителем, который испускает свет определенного цвета при освещении узким лучом света. Образец рассматривается через конфокальный микроскоп, который использует крошечную диафрагму, чтобы собирать свет только с очень малой части образца. Образец помещают под диафрагму и делают множество снимков для достижения полной картины.
Ограниченное возбуждение красителя
Как правило, разрешение определяется минимальным размером пятна облучения светом ? которое не может быть меньше дифракционного предела. Тем не менее, Стефан Хэль придумал хитрый способ сужения эффективной ширины светового пятна. Это достигается импульсным вторым лучом света, который накладывается на пятно. Однако, в отличие от оригинального пятна, интенсивность этого второго луча наибольшая на внешнем крае и быстро спадает по направлению к центру. Второй луч возбуждает краситель с помощью вынужденного излучения, что предотвращает возникновение флуоресценции там, где второй луч наиболее интенсивен. Из-за профиля интенсивности второго пучка, флуоресценция возникает только в центре светового пятна. Эта область, которая напоминает отверстие в центре бублика, гораздо меньше, чем разрешено дифракционным пределом.
STED-модуль может быть использован с обычным сканирующим конфокальным микроскопом для достижения пространственного разрешения около 50-70 нм - и коммерческая версия доступна от производителя микроскопов Leica.
Теперь, Стефан Хэль и его коллеги нашли способ улучшить STED, чтобы получить еще более четкое изображение. Как правило, STED-изображения получают в режиме непрерывной волны (CW-mode). Тем не менее, исследователи обнаружили, что необходимо несколько наносекунд до STED-бублика, по сути, обедненного ранее возбужденными молекулами в наружных частях бублика. Это означает, что любые снимки, сделанные в этот начальный период размыты из-за того, что сигнал все еще исходит от неистощенной области во внешних частях - и такие изображения не могут полностью использовать STED -эффект.
Отвергая ранний свет
Чтобы обойти эту проблему команда изобрела стробированный STED — или g–STED — который отвергает этот ранний свет. При этом команда смогла получить гораздо более четкое изображение (см. рисунок) и разрешить структуры размером менее 50 нм.
Еще одним преимуществом метода является то, что теперь четкие изображения могут быть получены с помощью гораздо меньшего количества света, - и, следовательно, с меньшим временем экспозиции. Это означает, что он может быть использован для записи движений молекул. Кроме того, тот факт, что требуется гораздо меньше света для получения резкого изображения означает, что живая клетка-цели будет менее повреждена во время облучения.
Обе эти возможности будут приветствоваться STED-пользователями, по словам Пола О'Ши (Paul O'Shea) из Ноттингемского университета в Великобритании. "Были некоторые опасения, что фотоны методов визуализации, такие как STED могут привести к разрушению клеток, так что g-STED подход очень приветствуется", говорит О'Ши.
Производство нового типа микроскопов будет запущено в первой половине 2012 года и представители фирмы Leica утверждают, что существующие STED-микроскопы могут быть модернизированы под g-STED.